FRET peptid technológia

Fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer (FRET)

A fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer (FRET) egy nem sugárzó energiaátviteli folyamat, amelyben a donor gerjesztett állapotú energiája intermolekuláris elektromos párok kölcsönhatása révén kerül át az akceptor gerjesztett állapotba.Ez a folyamat nem vesz részt fotonokban, ezért nem sugárzó.Ennek a vizsgálatnak az az előnye, hogy gyors, érzékeny és egyszerű.

A FRET vizsgálatban használt festék azonos lehet.De a legtöbb alkalmazásban valójában különböző színezékeket használnak.Röviden, a fényrezonancia energia átvitele egy dipóluspár átvitele a donortól (1. festék) az akceptorhoz (2. festék), amikor a donorcsoport gerjesztett.Általánosságban elmondható, hogy a Donor fluorofor csoport emissziós spektruma átfedésben van az Acceptor csoport abszorpciós spektrumával."Ha a két fluorofor közötti távolság megfelelő (10-100 A), megfigyelhető a fluorofor energia átvitele a donortól az akceptorig."Az energiaátvitel módja a receptor kémiai szerkezetétől függ:

1. Molekuláris rezgéssé alakul, vagyis az energiaátvitel világító fénye eltűnik.(A receptor egy fényoltó)

2. Az emisszió intenzívebb, mint maga a receptor, ami vöröseltolódást eredményez a másodlagos fluoreszcencia spektrumban.”(A receptorok fénysugárzók).

A donorcsoport (EDANS) és az akceptorgén (DABCYL) egységesen kapcsolódik a HIV-proteáz természetes szubsztrátjához, és ha a szubsztrát nincs leválasztva, a DABCYL elfojthatja az EDANS-t, majd fluor számára kimutathatatlanná válik.A HIV-1 proteáz szétkapcsolása után az EDANS-t a DABCYL már nem oltja ki, és az EDANS luciferázok ezt követően kimutathatók.A proteáz inhibitorok elérhetősége az EDANS fluoreszcencia intenzitásának változásával követhető nyomon.

A FRET peptidek kényelmes eszközök a peptidáz nemspecifitás vizsgálatára.Mivel reakciófolyamata folyamatosan nyomon követhető, kényelmes módszert biztosít az enzimaktivitás kimutatására.A peptidkötések donor/akceptor általi hidrolízise után keletkező fény az enzimaktivitás mértékét adja nanomoláris koncentrációknál.Ha a FRET peptid sértetlen, akkor a belső villanás hirtelen eltűnését mutatja, de ha a donor/akceptorral szemközti bármely peptidkötés megszakad, felszabadul egy villanás, amely folyamatosan detektálható, majd az enzimaktivitás számszerűsíthető.